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一言居士の独言

一枚報告補記

『一枚報告補記』

(決定的証拠)

以下の図はArticle Figure 4-aである。ここに若山さんの嘘を証明する写真が残されていた。

1補記

キメラ作成の概念図の下に、実際に若山さんが実験を行っている4枚の写真がある。左の端から、小保方さんが若山さんに渡したSTAP酸浴細胞塊、それをナイフカットしているところ、切り離された断片、そしてその断片をガラス管で吸い取ったものをキメラ作成のためのマウス胚盤胞にイジェクトしているところである。写真が小さいので気づかれにくかったが、以下が右端の写真だけを拡大したものである。

大きさ比較

左がArticle Figure 4-aの下段に4つ並んでいる写真の右端を拡大したもので、右はNPO法人・発生工学研究会のホームページにあるES細胞の胚盤胞移植写真です。背景の2本の黒線は両方の胚盤胞の大きさを縮尺調整して同じになるように目安として私が入れた線です。マウス胚盤胞の大きさは直径ほぼ140マイクロメーターなので、黒線の間隔がその径となる。

左の若山さんの写真は拡大しているのでパイプの中やパイプの先にあるSTAP細胞の一つ一つが右側のES細胞と比較して如何に小さいかがよくわかる。

挿入用の管は胚盤胞を壊さないためにはできるだけ細い方が良いので、通常はガラス管を火であぶってES細胞の大きさに合わせて管をその都度作る。STAP細胞のナイフカット手法ではカット後の断片がES細胞の直径より大きいので太めの管を作っていることは左右を比較すると一目瞭然です。この太い管を挿入してそれでも胚盤胞を壊さないようにするには手技が必要となる。

笹井さんは2014/4/16の記者会見での記者の質問に対して、小保方さんが既存のES細胞を若山さんに渡して騙そうとしても大きさが違うからすぐわかると答えています。

左の写真の管の中の後ろの方にばらけたSTAP細胞が2,3個見える。右のES細胞と比較すると直径で半分以下です。直径が半分ですと面積では1/4です。実際そのように見えますね。でも体積は更に1/8です。左の写真のパイプの先に挿入した小さなSTAP細胞がたくさん見えますが、更に奥に大きな細胞が見えます。これがリシピエントのインナーセルマスなんです。その大きさは右側のES細胞とほぼ同じだと見えます。もともとES細胞というのはこのインナーセルマスを取り出して培養増殖させたものです。大きさは変わりませんが無限増殖します。

笹井さんはES細胞だったら若山さんは気づくといいましたが、笹井さんの記者会見の2か月後の2014/6/16に行われた自身の記者会見で、若山さんは記者の質問に答えて分からなかったと証言しています。やり取りの詳細は以下です。
>>
(全録)STAP細胞論文の共著者・若山照彦教授会見 質疑応答(2/4)
8:30/42:12~

(朝日新聞岡崎女性記者)
で、先生は実際に、その、STAP細胞からキメラマウスを造ったり、その、幹細胞を作成されたりして、実際に、その、細胞を見てるわけですけど、見た目、外観からすると、全く今までと違った細胞で、あの、他の類似した細胞というのは見たことなかったのでしょうか。

(若山さん)
マイクロマニピュレーターの上に細胞を乗せてしまって、そこからキメラとかを作るわけですが、その状態になってしまうと、あと、あの、今回に関しては、それまでずっと失敗続きだったということもあって、ええ、普通、キメラマウスを作るときは、細胞をバラバラにして、キメラを作るんですが、塊のまま入れてみようという、そういうアイデアで実験をしたということもあり、いつもと違う手法を取り入れた、その時に成功したんです。そのために、その時の細胞が以前と違っていたかどうかというのが分からないままなんです。

(朝日新聞岡崎女性記者)
では、その、もしかしたら、その、万が一ES細胞だったとした場合、それを、これが新しい細胞ですと言われて、ほんとに、見分けがつかなかったんですかね。

(若山さん)
そうですね。その時点では、あの、新しい手法でやってしまったので、見慣れた外観は全くないので、どの細胞だったかということは区別できなかったと思います。



嘘ですね。それを証明しているのが上の比較写真です。誰でもわかりますね。笹井さんの言ったとおりです。当時専門家も気づかなかった。一つには論文をまだよく検討できてないということと、Article Figure 4-aの写真が小さくて、この管の中に大きさ比較できるものが写り込んでいるということに気づかなかったんですね。専門家は無論ES細胞の胚盤胞移植実験はよく知っています。でもSTAP細胞の大きさに関して直感的な認識がなかった。笹井さんは論文を書き直してやっている時によく見ていますから彼だけはES細胞なら分かるはずだと思ったんです。STAP細胞の大きさに関してはArticle Figure 1-gとExtended Data Figure 8-eにも図が掲載されているんですが、小保方さんは形態だけの比較で写真の縮尺を変えているから、これも気づかれにくいんですね。以下はそれぞれの写真の下部に表示されている1マイクロメーターのスケールの長さを合わせて比較したものです。

幹細胞はES

これも一目瞭然だと思います。笹井さんは小保方さんと机を並べてプロジェクターで図表の一つ一つを確認しながら論文をチェックしてあげている過程で大きさに関しての比較認識を持っていたわけです。ES細胞を浮遊培養して作ると見分けがつかないとか言葉だけであれこれと推測を述べていた専門家たちはこの大きさの問題には、本物を見たことが無く、直感を持っていないから気づかないんですね。

(推論考察の前提)

若山さんは嘘をついています。そしてその嘘は最初のキメラ成功時の話にまで及んでいます。彼は小保方さんに対して当時ナイフ切り分けでできたと言った。そして事件化後には小保方さんにES細胞を渡されたと主張した。でもES細胞を渡されていたらパイプの引き延ばしはどうしたのでしょうかね。STAP細胞の挿入写真ではパイプの中に数十個は入ってます。同様にES細胞の塊をナイフカットして数十個の大きさにしたら胚盤胞には挿入できないほどのパイプの大きさになりますよ。つまりES細胞はそもそもトリプシンでばらして一個ずつ吸い取ってからでしか入らないんです。裏返すとテクニックこそ必要であれ、曲りなりにでも数十個の塊で入れられるということはどんなに個々のSTAP細胞が小さいかを知っていたということです。若山さんの嘘は明白ですね。

ここで最も大事なことは、小保方さんが既存のES細胞を若山さんに気づかれることなく渡すことはできないと証明されたことです。既存ES細胞を使ったのなら犯人はむしろ若山さん自身だということになる。ただ、若山さんがそんな単純な捏造をするはずは無いが、実際には何をしたからキメラができたのだろうかという方向に推論が行かないといけないのに、若山さんは既存ES細胞で捏造なんてするはずはないから、既存ES細胞を使ったのなら犯人は小保方さんだと堂々巡りする。若山さんに気づかれずに小保方さんが既存ES細胞を若山さんに渡すことはできないのだと、今証明された以上、既存ES細胞なら若山さんは犯人ではないというところに戻ってはいけない。既存ES細胞で捏造されたのではないというところに、まず、思考の固定軸を作らないといけないんです。桂報告書及びBCA報告の結論は間違っているのです。

(キメラは論文通りに作られたのか)

思考の固定軸は既存ES細胞を渡されたのだという若山さんの主張は嘘だということです。ナイフ切り分けしたからできたと自分は思っていたが、実際には既存ESを小保方さんに騙されて渡されていたからできていたのだと主張していることは、今や嘘だと判明した。しかし、現実にキメラはできている。既存ESでないことは今証明されたのであるからには、キメラは論文通りに作られていたか、さもなければ別の手法で作られたのである。
この決定的な証拠の出る前には3つの可能性が検討されていた。

①小保方さんが若山さんに既存ES細胞を渡したからキメラができた。
②キメラは論文記載の通りにできている。
③キメラは小保方細胞核使用ntESで作られた若山さんの別の実験のものである。

①は完全否定されて、桂報告書とBCA報告の結論は間違いであると証明された。②と③のどちらが正しいのかが残された問題です。

キメラは論文通りにちゃんとナイフ切り分けでできていたのだけれども、自分自身が特許の件に不満があったとか、iPS細胞やミューズ細胞との予算獲得競争者や裏についている製薬会社等の圧力や脅迫に負けた等の、私にはわかりませんが、何らかの理由で若山さんが論文を取り下げようとして、キメラは既存ES細胞を渡されたからできたのだと嘘をついたという推論と、そうではなくて若山さんは論文通りの方法ではキメラを作っていないのに、笹井さんの圧倒的な信用力で間違った論文が通りそうになったので、全てを小保方さんの所為にして、論文を取り下げようとしたのだという私の説です。

私の説を概括しておくと、若山さんはスタンダードなプロトコルではキメラができないということを確認した後、小保方核使用ntESからキメラを作ることによって、小保方細胞の性質を見極めようとする別の実験を計画していた。そして米国に帰って、自分の研究を続けようとしている小保方さんを、人事秘の解ける翌年初頭に山梨大の助手で採用するという条件提示ができるまでの間、一時的に日本に引き留めておくために、自分のntES化実験で作ったキメラをなぜできたかを語らずに、むしろナイフ切り分けでできたと嘘をついたのだという説です。

以上










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  1. 2019/08/27(火) 14:55:28|
  2. 一枚報告補記
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一枚報告補記2

『一枚報告補記2』

(基本にある虚偽)

小保方さんに太田ESの細胞塊を渡されて、それが普段と違うということに気づかなかった若山さんは、最初のキメラ実験のときにそれをナイフで20個ほどの大きさにカットして胚盤胞に挿入したんですね。ES細胞の大きさは以下の図の右にある。この細胞の20個分は左の写真にはなりませんよね。そんな大きなパイプは胚盤胞に挿入できません。左の写真は実際に小保方さんが渡した細胞塊をナイフカットして挿入している時の写真です。中に入っているのはES細胞ではありませんね。
若山さんは以後ずっとES細胞で騙されてキメラを作り続けていたと言ってることになる。嘘ですね。

大きさ比較

キメラと幹細胞は実際に存在しています。どうやって作られたかの可能性は以下の3つです。

①キメラと幹細胞は論文通りに作られたのに、若山さんはそれを既存ESによる捏造であったとして取り下げた。
②キメラと幹細胞は小保方核使用ntES実験で作られたものである。
③キメラと幹細胞は論文とは別の、又ntESでもない、何か違う手法で作られたものである。

2012年初頭から始まった二度目の実験で、F1は「僕のマウス」を渡したと若山さんは証言した。ところがその時のSTAP由来2Nキメラのジャームライントランスミッション結果であるカルスキメラ子1~9のDNAからAcr-CAG-GFPが検出された。
太田ESは使われていないということが証明されている以上、この「僕のマウス」を渡したという若山さんの証言も嘘であることが証明された。彼は129/SvX1と岡部マウスとのF1の赤ちゃんを小保方さんに渡したということが立証されたのである。
このことによって、2011年11月の最初のF1キメラマウス背景を若山さんの実験ノートと証言によって桂報告書が(「129/Sv×B6GFP」 が正しい)と書いている(B6GFP)は岡部マウスであったからこそ、その後のテラトーマからもAcr-CAGが出たのだと知れる。テラトーマの上からその時にできていたF1の幹細胞を注射したのは若山さんしかいないことも立証された。
このことは手記206Pの(「若山先生は光る精子で実験をしていました」)という記述と矛盾しない。そもそも岡部マウスを維持しているのだから当然ですね。記者会見ではアクロシンが発見される経緯を自然に見せるために岡部マウスにはあたかも気づきもしないというポーズで、遠藤氏が言い出すまで知らんふりしていた。そもそも最初に疑うべきは太田ESではなくて岡部マウスでしょ。太田ESだと言いだして4種の細胞を取り寄せたのは若山さんです。
太田ESを若山さんに気づかせることなく小保方さんが渡すことは不可能であると証明された以上、太田ESはキメラ作成にも幹細胞作成にも使われていない。しかし、現実には桂報告とBCA報告はFES1=FLS3=129/GFPESとしている。太田ES即ちFES1は使われていない。これは何を意味しているのか。FLS3=129/GFPES=FES1ということである。若山さんがFES1ラベルのチューブの中身をFLS3に入れ替えたということが立証されているのです。この件は早くから和モガさんが近親率から導いている結論でもありますね。

太田細胞が桂調査チームにもたらされた輸送経路こそ、今Ooboe さんのパートナー氏が神戸地方検察庁特別刑事部で検討していただいている申告書の嫌疑です。すべては山梨大若山研を経由している。

(幹細胞のTCR再構成)

小保方さんの酸浴細胞にはTCR再構成がありました。白線を入れてないルール違反だと大騒ぎしましたが、TCR再構成があることは石井さんも認めましたね。

全比較

レーン4がCD45(白血球の分化抗原)陽性細胞、5と6がSorted Oct4+細胞、つまりその酸浴STAP細胞でOct4-GFPが蛍光しているものです。すべてのリアレンジバンドの出ていることが確認できる。多種のTCR再構成を起こしているT細胞をたくさん含んでいるポリクローナルな細胞集団ですから全バンドがでるんです。小保方さんのプライマーはD2-J2.6で挟んでいる。出るべきバンドは以下でしたね。
>>
01.D1-J1の123456-D2-J2の123456(*GL)
02.D1-J1の23456-D2-J2の123456(*GL)
03.D1-J1の3456-D2-J2の123456(*GL)
04.D1-J1の456-D2-J2の123456(*GL)
05.D1-J1の56-D2-J2の123456(*GL)
06.D1-J1の6-D2-J2の123456(*GL)
07.D1-J2の123456
08.D1-J2の23456
09.D1-J2の3456
10.D1-J2の456
11.D1-J2の56
12.D1-J2の6
13.D1-J1の123456-D2-J2の234567(*リアレンジバンド)
14.D1-J1の123456-D2-J2の3456(*リアレンジバンド)
15.D1-J1の123456-D2-J2の456(*リアレンジバンド)
16.D1-J1の123456-D2-J2の56(*リアレンジバンド)
17.D1-J1の123456-D2-J2の6(*リアレンジバンド)

細かい話は端折ります。01~06まではGLバンドです。小保方さんのプライマーで挟まれた一番長い断片です。ここに入るのはこの他にT細胞以外の細胞もあります。T細胞でない細胞はTCR再構成を起こさないので遺伝子はそのままですから小保方さんのプライマーで挟まれると何も切断されていないそのままの長さで出ます。因みにES細胞だけの細胞集団だとGLバンドだけになります。
07~12までは小保方さんのプライマーの部分がTCRの結果切り捨てられていますのでPCRにかかってきませんから、バンドはでません。
13~17がそれぞれ長さの違うリアレンジバンドです。バンドはGLも入れて全部で6本出るんです。

これを前提にして、では幹細胞のTCR再構成PCR結果はどうかというと、これは発表されていません。丹羽さんが主導して、幹細胞とキメラのPCR結果は論文から外させたんです。なぜか。幹細胞は実物の写真がありませんから先にキメラから示しましょう。

バンド

これはGel2のレーン27,28,29の2Nキメラの体細胞のTCR再構成結果とされているものです。27,28に関して上から5番目の矢印のバンドがありません。キメラの場合はポリクローナルな細胞が一つの組織の中に均等に分散するということは考えにくいんです。又、この実験自体がリシピエントの白血球を完全除去できているかどうかも分からないんです。で、議論を呼んでいるところですが、幹細胞の場合をこのバンドの欠失しているところから想像力を働かせることができます。

論文のプロトコル通りに幹細胞を作ったとしましょう。上に示したようにCD45+細胞と酸浴STAP細胞のTCRバンドは全バンド出ている。ポリクローナルな細胞集団だから全バンドが出るわけです。それをそのまま論文にあるES培地で誘導しても、細胞集団がポリクローナルな集団であることは変わりません。つまり作り立ての幹細胞であれば全バンド出るのが普通で、これが全く出ないとか、或は一部しか出なくても、検証している人たちはおかしいと思うか、目的のバンドは出ていないと判断しなければならない。全バンド出ない限りはTCR再構成があったとは言えない。

では、実際にはどういう証言になっているかというと、手記によればまず幹細胞のPCRはラボの仲間が担当した。そして、結果は8株のうちに2,3株あるようだと聞いたような書き方になっている。この時点ですでにおかしいですね。全ラインに全バンド出るのが当たり前です。これを小保方さんは当時気づかずにラボのミーティングで、自分のSTAP細胞の結果と合わせて、TCR再構成はあったと報告したようです。後にラボ仲間の実験にはコントロールが無かったので自分でもう一度やり直したら全ラインなかったと手記に書いている。この"後に"の時期がいつのことなのかははっきりとは書かれていない。それから全ラインなかったという意味はそれぞれの株で全バンドが出ていないから無いと言ったのか、全ての株で一切バンドがなかったのかのどちらなのかも書かれていない。しかし、前者であっても実験結果としては無いという判断が正しい。なぜなら検体はポリクローナルな細胞集団であるという前提になっているからです。

丹羽さんは実験が何らかの理由で正しく行われていないのではないかと考えて、間違いなく全バンドの出ているSTAP細胞の結果だけをつけさせて、幹細胞とキメラの結果は外させたんです。キメラは2,3種類程度の移植細胞が調査した組織の中でキメラ化していると考えれば説明できないことはないが、それもちゃんと学会で承認されている事実でもないし、何よりも特許につけられている2Nキメラの結果はもっと説明のできないものです。実験は4Nで行われた方が確実でもありますから、この時点では後にちゃんと調べればいいと考えて、キメラと幹細胞に関しては論文に載せないことにした。そして幹細胞のTCR再構成のPCR確認バンドが無くなった理由として、笹井さんは培養によるバイアス選択だと説明した。若山さんが嘘をついているなんてことは考えもしていませんから、他に考えようがなかったということです。

我々は若山さんが嘘をついていることを知っている。小保方さんの渡した酸浴細胞塊をそのままES培地で誘導したものでないことを知っている。
我々のntES論だと、作られてくるいくつかの小保方細胞核使用ntESは一個の細胞のクローン胚からES化したものですから、一つ一つのシャーレの中はモノクローナルな細胞集団です。
検体がモノクローナルな細胞集団である場合にPCRにかかってくるTCR再構成バンドは0本か、1本か、2本のいずれかです。こうなるのは小保方さんのプライマーには挟まれない断片があるのと、無論染色体が二本あるからですね。
8株の中の2、3株に再構成があるようだったというのは、1本とか2本なら分かりますね。0本もあるでしょう。でも、前提となっているのはポリクローナルな細胞集団です。1本や2本あってもあったことにはならない。それは何かの実験上の手違いでしょうと解釈されるべきですね。丹羽さんと笹井さんが心配して外させたのはそれが理由です。彼らは医師でもある。小保方さんや、ラボ仲間はそんなにTCRに詳しいわけもないんですね。後で若山さんに幹細胞と4Nキメラを作り直してもらって、自分たちが指導してもう一度確認すればいいことだと考えたんですね。とても正しい判断だったのではないでしょうか。若山さんが途中で逃げただけです。


以上











  1. 2019/08/31(土) 10:42:12|
  2. 一枚報告補記
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一枚報告補記3

『一枚報告補記3』

(基本にある虚偽)

下のこの写真は西岡さんのガンバレブログに渋谷さんが2019/2/10に写真付きで指摘されたのが最初で、比較写真をアーティクルのものに変えて欲しいと楠本さんに何度もお願いしてなかなか思い通りの比較写真にならなかったものです。やっと自分で加工できるようになったので自分のブログにアップしました。私としては一目瞭然だと思ってましたが、渋谷さんが指摘されたときもそうですが、細かく説明しないと人にはなかなか伝わらないものだと今回実感しました。新しい学さんのブログに何か初心の方が間違ったことをたくさん書き込まれていますが、成程ああいう風に誤解されるものなのだとわかります。いい機会ですので、基礎的なところも説明しておきましょう。

大きさ比較

①マウスの卵の大きさは排卵時直径140マイクロメーター程度で、子宮に着床するまで卵管の中を移動しながら卵割が進みますが、栄養の補給が卵管壁からのわずかの水分と栄養以外にありませんから、大きさはほとんど変わらない。卵割の最終段階が上の胚盤胞(ブラストシスト)期で、この後ハッチングして殻を出て、後期胚盤胞(エビブラスト)となって、子宮壁に着床(インプランテーション)します。このときはすでに胎児となる場所が決まっています。着床して子宮壁に埋もれると子宮側と胎児側の両方から胎盤が形成されて栄養補給と排泄が可能になり新陳代謝が活発になって急激に大きくなり始めます。以下がその概念図です。

卵管

②移植写真の左側の胚盤胞を支えているパイプのことをホウルディングパイペットといいます。卵を吸引固定している。右側のガラス管はインジェクションパイペットで、ドナー細胞を吸引してからリシピエント卵の中に押し出す。細かい操作は顕微鏡にセットする補助機械があるんです。ただしパイペット部分は人が加工します。以下がその加工の写真です。カッティングニードルというのは除核卵を作るときとか、移植するドナー核を取り出すときに使われるものですが、若山さんはSTAP細胞塊をカットするときに使っているところが写真にありますね。

バイペット

バイペット2

③キメラ胚作製移植写真の左右でホウルディングパイペットの大きさが違うのは作った人が別人で引き伸ばしたガラス管の径が少し違うからです。

④若山さんが移植している小さな細胞の集合体は若山さんが小保方さんから受け取った細胞です。移植しているのは若山さんで、小保方さんはこういうことはできません。できるなら若山研にキメラ作成をお願いには来ていません。

⑤カッティングニードルはArticle Figure 4-aでは細胞塊のカットに使われていますが、我々のntES論においては、もっと先を細くしてあの小さな小保方細胞の一つずつの核を取り出すために使われているはずだと考えています。とても繊細な技術が必要だったと思われます。自分にしかできないと若山さんが小保方さんに語ったのはむしろそういう意味だと見ています。他は清成さんにできましたね。

余談ですが、若山さんはこの頃ワクワクしていたと思いますよ。ナイフカット塊の移植実験はもっと前から先に行っていてできなかったのだと思ってます。できなかったからこそ、ntES化実験に切り替えて、キメラを作成して、小保方細胞の性質を見極めようとした。彼は当初小保方細胞は何物かだと信じていたんですね。この後かなり勘違いがあったと思います。今でもTs.Markerさんたちがこの頃の幹細胞の性質を確認し続けていますが、これは恐らく若山さんのntESの性質に過ぎないと思っています。若山さんは試験管内三胚葉分化する小保方細胞の核を使ったと当初信じていたと思いますが、丹羽さんの検証を参照する限り、彼は結果的にはリンパ球のntESの性質を調べることになっただけだと思います。ただ、彼は小保方細胞に出会ったことによってはじめて自分の細胞をあのように分析することになったのだと思います。特に笹井さんが行った幹細胞の検証結果は若山さんは初めての知見だったと思います。
まあ、先走るのはよしましょう。何れ本当のことが分かってくると思います。とりあえず、移植写真は太田ES細胞ではないのだということです。



















  1. 2019/09/03(火) 07:34:30|
  2. 一枚報告補記
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一枚報告補記4

『一枚報告補記4』

(基本にある虚偽)


いろんなブログを覗いていますが、基礎的なところで戸惑っておられる方が多いようですね。まず大きさの認識を受け入れないと他のことをいくら論じても無駄ですよね。胚盤胞の大きさというのはある程度は幅がありますね。そういう実験の動画を見たことないんでしょうかね。集めた胚盤胞の大きいのを選別しているところなんか、小さいのは成長が悪いんです。そういう大きさの違いと卵管からのわずかな水分と栄養補給以外には着床以前に大きくなれる要素が無いのだということとは違います。中にはホウルディングバイペットの径が基準だなんておっしゃる方もある。自分でやってみて確認すればいいんですがね。胚盤胞は幾分小さくなりますが、中のES細胞とSTAP細胞の大きさの違いはカバーできませんね。そもそもバイペットは人それぞれ使いやすく作るので既製品の大きさではない。先端を溶かして丸めるので形状は皆それぞれ微妙に違いますね。

STAP細胞塊8

STAP塊にも大きい細胞が若干ありますね。それをもってES細胞と変わらないとおっしゃってる方もあるようです。でも胚盤胞の中に小さいのばかりを選んで入れているのは若山さんだということを忘れているんでしょうかね。一つは画像が小さいということがあるんでしょうね。私は49インチのモニターで見ていて、かつ拡大していますから正に一目瞭然なんですけど、普通のPCモニターやノートパソコン、ましてやスマートフォンの画面では拡大しても直覚をえられませんかね。

以下は若山さんが選んで入れたSTAP細胞塊の部分拡大図です。パイプの中とパイプの先に塊がある。後ろに2、3個バラバラになったのがある。拡大するとぼやけますが上の図でも確認できますね。

STAP細胞塊6

以下は、ES細胞の大きさをSTAP細胞の大きさに合わせた比較図です。黒線の幅がES一個分の径です。若山さんは見分けがつかなかったとおっしゃったんです。ESを入れるときの胚盤胞ってSTAPを入れるときとこんなに大きさが違うなんてことはありませんよね。下の写真はホウルディングパイペットの先端側に大きな細胞がいくつか見えるものです。でも大半は小さいもので、しかも、若山さんが大きいのは入れてない。パイプの先と中にあるものを確認したらわかりますね。ES並みに大きいのは入ってない。選択しているのは若山さんです。大きさの違いをご本人が分かっているということです。

STAP細胞塊9


いいですよね。若山さんは嘘をついていますね。桂報告書とBCA報告の大前提が覆っているんです。ゴルフのプロはバックティーから打つんですね。グリーンは普段アマチュアの見ている景色とは全然違いますよね。桂報告書とBCA報告書を書いた人々には後ろから打ち直してもらわないといけない。

大きさ比較

どうしてSTAP幹細胞はCD45より大きくなっているのかな。バックティーから打って見せて欲しいですね。

幹細胞はES












  1. 2019/09/04(水) 08:58:54|
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一枚報告補記5

『一枚報告補記5』

(基本にある虚偽)

[大きさの認識]


頑張れブログに櫻井さんというかたが「専門的な説明は、有難いですね。」と書き込まれている。私はど素人ですが比較的長くやってますから泥縄で集めたデータをたくさん持っています。キメラ胚の関連画像や動画はたくさんありますね。いくつか紹介しましょう。
まず、以下の動画はヒトの卵です。倫理的制約の中でとても貴重なビデオですね。3日目から5日目までです。6細胞程度からエピプラストまでです。

*ttps://www.youtube.com/watch?v=uCn1PQP2yAo
Blastocyst Development - Day 3 to Day 5 (MUST SEE)

桑実胚までは大きさが変わらないことを確認してください。固い殻の中で卵割して行っているだけです。胚盤胞になっても最初は変わりませんが途中から急に大きくなりますね。1.5倍程度に膨らんだものをexpanded blastcystといいます。この後にハッチングして殻を脱ぎ捨てる準備です。ヒトは哺乳類ですからね。魚や鳥と違うところです。真っ裸になってお母さんの子宮に着床する前段階がエピブラストですね。

[胎盤形成に関する予備知識]

この後はすぐに子宮に着床して胎盤が形成される。この胎盤が形成されるときにトロフォブラストが胎児側胎盤になる。ES細胞だと4Nキメラでもトロフォブラストを形成しないから胎児側胎盤は実はリシピエントの胎児胎盤になるようです。若山研関係の論文にありますね。STAP細胞は胎盤にも貢献すると若山さんが言いだした。キメラは胚盤胞の中にESなりSTAPを入れます。胚盤胞の外側はリシピエントのトロフォブラストが既にできている。そこにSTAP細胞からのトロフォブラストが侵入してくるという仮説だったんですね。私にはほとんどイメージできませんけどね。これが若山さんの作ったTS-like cells仮説ですね。できた新手の幹細胞は若山さんと桂報告の主張によると太田ESをTS培地で誘導したものということになるんでしょうね。和モガさんやTs.Markerさんたちが解析して首をひねっているところですね。通常の受精卵細胞とは違いますね。
言うまでもありませんが、我々のntES論ではこれはntESですからね。ntESの胎盤の特徴だと見ないといけません。この若山さんの作った小保方細胞核使用ntESはまずは元が原則としてT細胞だということですから、PCRに掛けるとTCR再構成は0本か、1本か2本のバンドのいずれかになる。0本というのは相同染色体のどちらもが小保方さんのプライマー部分が欠失して挟めないから断片バンドが出ない場合、1本というのは一方が欠失で、他方がGLを含めた6本の再構成バンドのいずれかになっている場合と、どちらもGLになっている場合です。TCR再構成の仕組みとしてどちらも同じ再構成バンドにはなりませんが、GLだけは別の場所で異なる再構成があるが、小保方さんの挟んだ部分ではGLのまま変化ない場合が複数あるんです。2本は6本の中でそれぞれ別の二つを選ぶ組み合わせです。
これが太田ESであった場合は必ず1本になります。GLバンドだけがでる。0本とか2本というケースはT細胞だからそうなるんです。0本とか2本とが出たらT細胞由来細胞だという証拠です。因みに太田ntESはマウスの尻尾由来ですね。FES1は受精卵ESですからどちらも当然GLバンドしか出ませんね。遺伝子にそもそも欠失のある多能性細胞なんて、小保方さんの特殊な実験くらいでしか使いません。

DNAですからね。ちゃんと実験したらバンドが消えてたなんてことはありません。笹井さんは若山さんが嘘をついているとは考えませんでしたからね。長期培養で選択バイアスかかったと考えた。例えばシャーレの中でB細胞ばかりになってしまったなどというケースです。だったら元の冷凍細胞を使えばいいんです。嘘をついていると考えていいのだったら、PCRくらい何度でもやり直させたでしょう。バンドが0本というのは受精卵や体細胞ではないということです。今ちゃんとやり直したらいいんですよ。幹細胞はたくさん残っているじゃないですか。プロフェッショナルにバックティーから打って見せて欲しいというのはそういう意味です。全部GLラインになりますかね。桂報告書の結論はそういうことになると主張していることになるんだから、今やったら簡単にこの問題は解決する。警察が入ったらすぐ終わるんです。小保方さんは血球を使っている。既存のESは受精卵ESです。学生のGOF-ESはntESだが血球を使ってないからGLラインしか出ない。GLとGLSのTCR再構成のPCR検査をしたらいい。学生のだったらGLライン一本です。小保方さんの細胞を若山さんがもちゃもちゃしていたら0本とか2本があり得るでしょうね。
小保方さんは胎児胎盤卵黄嚢のGFP検査を頼まれただけです。STAP細胞由来キメラとFI-SCキメラ由来の胎児胎盤は若山さんが作った。我々は幹細胞GLや幹細胞GLSの中身は小保方さんの持っていた学生のGOF-ESの中身を洗い出してGLSを入れたものとみています。逆はすべて入れ替えないといけないので大変です。凍結細胞を全部調べたら一発で分かるでしょう。

[キメラ移植用expanded blastcystの大きさ]

胚盤胞注入に使うのは上記ヴィデオのexpanded blastcystです。上記ヴィデオはヒトですから遅いですが、マウスの場合はこの段階はプラグ閉鎖確認後3.5日目ですから、その頃に帝王切開して取り出す。4日目だともうハッチング始めてるから遅い。5日目の胚盤胞だなんて人間でもハッチングし始めてますね。マウスによって少し時間が違ってきますから、完全に大きくなって今にもハッチングしそうなのから、まだ胚盤胞のなりたてで小さいのもある。一匹で20個位取れるらしいですね。Article Extended Data Figure 7-aでは262個の胚盤胞を使っていますね。10ペア以上のメイティングを行って、丁度キメラ作成時に3.5日になっているように準備する。大目に作らないといけないですね。ダメな卵は使いません。

下は取り出した胚盤胞の大きさの比較です。どの程度大きさが違うか。

E35.png

この程度には違うが、パイプで吸い取るときに平均サイズ以下を吸い取りますから、サイズはこれほどには違わない。違ってもこの程度ということです。

半分径


径の差を最大に1/2にしてもまだES細胞はSTAP細胞のにまで小さくならない。実際には径がこれほど違うものに移植するということもありません。大体同じ大きさを選ぶ。誰がやっても似たようなものです。プラグ閉鎖から3.5日だからです。

以下はキメラインジェクション動画です。ESを吸いとるときもパイプ径に合わせて吸い取ってますね。これは胚盤胞とES細胞と一緒にしたシャーレの中で作業している。胚盤胞にも大小があるが大差ある奴は入れない。選ばれた一個の前方のが少し小さいですね。無論大きい方が入れやすいに決まってますから入れる人は大きいのから選ぶ。準備するときパイプて゜吸い取ってるからその径でできるだけ大きいのを選ぶとほぼ同じになってくる。

*ttps://www.youtube.com/watch?v=yByw0IdRMlI
Chimeric Mouse Injection Procedure

大きさの問題はそろそろいいでしょうかね。ホウルディングバイペットの大きさに合わせるなんて言ってた人はどこにいったのでしょうかね。自分の言ったことをほったらかして別の人間が別のことを言いだすのがスピン屋グループの昔からの特徴ですね。
動画のパイペットはとても太いですね。若山さんは細目ですね。受けてる側の面積の違いで圧をかけた時の力の分散の問題があるんでしょうね。太さが違うということはそこに一長一短があるということでしょうね。ど素人にはうかがい知れないですね。ただ挿入されたES細胞と胚盤胞との相対的大きさ比較は同じですね。大きさは一目でわかるということです。大体皆同じ作業をしている。ES細胞とSTAP細胞の大きさが分からなかったと若山さんが言ったのは嘘ですね。ナイフ切り分けしたときにできたんですよ。だから見慣れた姿が無かったと。その後何度もキメラを作っているはずなのを忘れてますよね。実際にはこんなことは最初の一回だけで後はやってないからです。

[ES1個でキメラを作る方法]

大粒の1,2個が入ればESキメラが出来てしまうと考えた人もあるようですね。何もかも一緒くたにしないでひとつづつ整理して片付けていきましょう。大きさの問題はここで一旦終わりです。

ヴィデオを見ればわかりますが、大体ESキメラの場合は20個~30個位入れるんですね。そのくらい入れないとキメラにならない。因みにテラトーマの場合は10の5乗は必要です。全部ESで10の5乗無いとできない。相沢さんが、小保方蛍光細胞の中の内在性Oct4-遺伝子発現の少なさから、それだけの数の細胞を集めることはできないとテラトーマ実験は中止しました。ティシュー論文以来、小保方さんはスタンダードなテラトーマは作っていません。ヴァカンティ足場を使っていわば試験管ごと皮下に埋納しただけのテラトーマライクです。博論も同じです。これは分化培養液ですから1個でも入っていると分化増殖します。ESでも同じです。1粒でも入っていると確率的には分化培養結果が出る。小保方さんはスフィア塊を入れた30~50シャーレに一つ分化してくると報告していて、丹羽さんの内在性Oct4発現細胞の確率検証結果と違いませんね。
小保方細胞というのはそういう段階の細胞だったんです。

ある日、突然、ナイフ切り分けしたらキメラができた。切り分けた塊の中に1粒2粒ES細胞が入っていたという説のようです。あんまりたくさん入っていたらこれは何だろうと大きさの違いで若山さんが気づきますからね。スフィア塊の構成細胞数はほぼ1000個平均です。これは丹羽さんの撮った写真でも数学的に確認できますね。球体ですからね。直径上の細胞数を数えたらわかる。スフィア塊というのはCD45陽性細胞を酸浴させた後に1週間培地に入れて置く。最初からES細胞を入れたらESの増殖力でSTAPは絶滅してしまいますから、渡す寸前に入れるんでしょうね。パイペットで吸い取ってスフィア塊の上に何個がポトリと落とす。あのカット写真の一部にぷりぷりとくっついている数個がES細胞だと。
そんなことしてコンパクションがうまくいくのかどうかも知りませんが、そもそもそういう操作は、使用に若山さんの許可のいる、マニピュレーター付きの電子顕微鏡で無いとできませんね。小保方さんは普通の電子顕微鏡しか使えないでしょう。いくつか大きめの細胞が見えるのは他の白血球でしょうね。マクロファージなんかは大きいですね。若山さんはそんなのは胚盤胞内に入れてませんね。

こういうキメラ胚を若山さんは262個作りました。Articl Extended Data Figure 7-bの結果ですね。

①B6GFP x DBA/2 58個
②129/Sc x B6GFP   98個
③BL6(oct4-gfp) 7days   73個
④BL6(oct4-gfp) 10days   35個


生まれてきたのが167個体で63%、内キメラ認識されたのが64個体で24%です。Extended Data Figure 8-jの下段にESキメラの2N実績があります。ES細胞を20個~30個入れたものです。53個のキメラ胚を作って、生まれたのが32個体で60%です。ジャームライントランスミッションできるまで成熟したキメラは21匹で40%です。こんなものなんですね。21,2個混ぜてはこんな結果になりませんね。小保方核使用ntESを20~30個移植したんです。キメラは出来て当たり前です。若山さんのところでは毎日やってる実験です。









  1. 2019/09/05(木) 11:34:16|
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