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一言居士の独言

学さんブログでの検討記録38

[Fig1d]
>>学さん
>アーティクル論文Fig1dで示されるように、5日目からSTAP細胞の6割位がGFP陽性細胞で、構成されます。こういう論文図表は逃さないでしっかり見て欲しいです。

あなたは再構成を起こしている白血球はDNAが不完全だからキメラの中で生き残らないのではないかとおっしゃった。ですからそうでない細胞はどういう細胞かということを問題にして、そういう細胞が7日目にたくさん残っていることは考えにくいと申し上げています。つまり最初に入っていた割合でそのまま酸浴後生き残りますねと申し上げている。アーティクル論文Fig1dでたくさんOct4-GFPを発現している大半はT細胞やB細胞でしょ。そうでない細胞は少ないですねと申し上げています。学仮説の話はまずそこから始まるんでしょ。確認をお願いします。以上です。

[蛍光しているのはリンパ球ではない?1 ]
>>学さん
>今ある細胞が生き残るかどうかです。

あなたはキメラの中で取捨選択が行われるのみではなくて7日間のSTAP変換途中でもT細胞やB細胞はサヴァイヴァルできなくて消滅もしくは減少してしまうとおっしゃってるんですか? 論文のSTAP細胞は別に白血球でなくてもどんな細胞からでもできるとされている。あなたのおっしゃっている③はT細胞やB細胞ではないという意味でその中の一つになるんですが、これらの細胞群はTCR再構成はありませんから小保方さんのプライマーで挟むとGLがでるだけです。つまり③の主張は同時に①を主張することになりますね。そのことをご確認なさってください。私は学さんと違ってとても頭が悪いもんですから、論理の階段は一段づつしか登れないんです。よろしくお願いします。以上です。
>>
①この2Nキメラとされているゲル2写真は偽物である
②本物であるが白血球を除去し忘れている
③本物であるが、FACSで選別しきれなかったT細胞以外の脾臓構成細胞のSTAP由来キメラである


[CD45の1]
>>学さん
>そのような事は言ってません。T細胞(CD45+CD3+)をあつめてSTAPにしたら、TCRがでましたよね。7日間に、どの臓器由来細胞も凝集して生き残れると思いますよ。

何がキメラになったかに関しての学仮説に対する私の理解に修正を入れて以下でいいわけですね。
>>
③本物であるが、FACSでCD45+選別されたものの中のT細胞やB細胞以外の細胞や、CD45+選別しきれずに混入した脾臓構成細胞やのいずれかのSTAP由来キメラである

確認をお願いします。

[CD45の2]
次に、石井調査資料の事実確認です。CD45は白血球の、CD3、CD90(Thy-1)はT細胞の分化抗原ですね。
まずGel1です。
①DNA ladder
②ES Cell
③Fibroblast
④CD45+ cells
⑤Sorted-Oct4+ 1
⑥Sorted-Oct4+ 2
⑦Sorted-Oct4+ 3
⑧Sorted-Oct4+ 4
⑨Sorted-Oct4+ 5
⑩Sorted-Oct4+ 6
⑪STAP cluster 1
⑫STAP cluster 2
⑬STAP cluster 3
⑭STAP cluster 4

[CD45の3]
次はGel2です。
⑮DNA ladder
⑯CD45+/CD3+ 1(100ng)
⑰CD45+/CD3+ 1'(50ng)
⑱CD45+/CD3+ 2(100ng)
⑲CD45+/CD3+ 2 (50ng)
⑳CD45+ 1
㉑CD45+ 2
㉒CD45+/CD90+
㉓CD45+/CD90+
㉔CD90 STAP1(Sorted-Oct4/<後ろ不明>
㉕CD90 STAP1(Sorted-Oct4/<後ろ不明>
㉖CD90 STAP1(Sorted-Oct4/<後ろ不明>
㉗2N chimera 1(CD45 STAP)
㉘2N chimera 2(CD45 STAP)
㉙2N chimera 3(CD45 STAP)

[CD45の4]
私は学さんのお陰でこの歳になって『喜ばしき知識』以外の何物でもない免疫学の入門教科書に(本体3,200円+税)なる浪費をさせらましたが、先生にはその責任を取られてせめて私が”喜ばしい”状態になるまではご指導願いたいものだと念じております。別に急いではおりません。
まず最初にラダーの数に関してです。小保方さんのプライマーで挟まれるDJリコンビネーションの組み合わせ数はGLを入れて15でいいですね。つまり小保方検査で現れて来うるラダーはあり得る場所を全部数えると15以上ではないと。

ここまでのところを確認いただきたい。たくさんのことを同時にご説明なさっていますが、いずれ先生のコメントは全部拾い出して検討することになります。うち捨てているわけではありません。順番に理解していけば私のような愚鈍な頭でも何れ正解に至ると信じておりますので、よろしくお願いいたします。以上です。



> 一言居士さん
いろいろご勉学なさってますね。
頑張ってくださいね。

細かい細胞種に関するやりとりは誤解を生じ易いので、ここではやりません。学とみ子の日本語能力にも問題あります。但し、学とみ子も易しい話であれば、他の方並みには文章を作れます。今は、ごめんなさい。

ため息陣営が一時も逃さずチェックして、ミスを誘います。彼らはミスでなくともミス呼ばわりです。そうした中で、難しい領域の議論に入ると、彼らの破壊作戦の餌食です。

一言居士さんは、ES混入説ではSTAP細胞を説明できないことを理解できているのだから、後はゆっくり進んでください。小保方氏から何らかアクションが出たら、又、共闘しましょう。
2019/6/10(月) 午前 11:47返信する


というわけで、議論は終わりましたが、私の感触ではあちら側とグルだと思います。


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  1. 2019/06/10(月) 09:31:42|
  2. 学さんブログ検討記録
  3. | コメント:0

学さんブログでの検討記録37

[FACS1]
>>学さん
ゲル2と特許図にキメラマウス尾部細胞らしきもののTCR再構成のPCR検査結果がある。あなたのご判断は以下です。
>>
(2)TCR痕跡があれば、STAP細胞は元のCD45からつくられたと言える

従って、写真が偽物であるか、検体に白血球が混じったりしていない限り、キメラ体細胞がT細胞由来であることは証明されたように見える。でも、あなたは小保方さんのこのPCR結果はそれ以外の由来細胞の存在を排除できてないとおっしゃる。

[FACS2]
例えばライブセルイメージングでは蛍光細胞が移動していてマクロファージが選別の際に検体の中に残っているのは明確です。おそらくこの時はCD45+のみでFACS選別したんでしょうね。でもゲル2において小保方さんはCD45+とCD3+でT細胞を選別している。TCR再構成を調べるということになって、できるだけT細胞のみを選別しようとしたわけです。そして、酸浴して蛍光しているSTAP細胞にはTCR再構成があった。論文の論旨的には、ここで証明されたことはOct4-GFPが発現していない体細胞であるT細胞が酸浴刺激によってOct4-GFPを発現し、光ったということです。光ったのは他のどんな幹細胞でもなく系譜決定されていたT細胞がリプログラムされたからなんだよと主張した。TCR再構成のPCR検査自体は検体がT細胞のみである限り酸浴前でも酸浴後でもラダーの出るのが当たり前ですね。

[FACS3]
そして、いよいよ若山さんが小保方さんの作ったこのときのT細胞由来STAP細胞をキメラ胚に移植して、2Nキメラを作った。そしてこのキメラマウスの、明確には書かれていないが、尾部であろう体細胞組織のDNAをPCRにかけて、小保方さんが論文に書いているプライマーで挟んだらラダーが出たということです。従って上述しているようにこの結果が本物なら、このキメラはES細胞由来ではないと証明されたことになる。つまり桂報告はでたらめだということです。どこにあったかも分からないような太田ESなんかは使われていないということです。

[FACS4]
従って、以後は、以下の二つを検討していけばいいわけです。私は今ジムさんのブログでそちらの方向に進んでいる。
①この2Nキメラとされているゲル2写真は偽物である
②本物であるが白血球を除去し忘れている

[FACS5]
ところが"ある派"のあなたはもう一つの可能性を主張なさっている。つまり、

③本物であるが、FACSで選別しきれなかったT細胞以外の脾臓構成細胞のSTAP由来キメラである

その根拠は不完全なDNAを持つ細胞は胚の中で排除されるというものですね。脾臓構成細胞の中でT細胞以外で一番多いのはB細胞ですが、無論あなたの説ではこれもありませんね。マクロファージを仄めかしておられましたかね。

[FACS6]
酸浴下では細胞は生き残るのが精いっぱいの努力で無論増殖は出来ませんが、FACS選別でわずかに含まれていたリンパ球以外のTCR、もしくはBCR再構成の無い白血球もしくは他の脾臓構成細胞が生き残って、しかも、酸浴でOct4-GFPを発現している細胞が7日目にたくさん残っているということはちょっと考えにくいので、最初に含まれていた割合で少量残る。それを若山さんが20個程度の塊で、100個程度のキメラ胚に入れたわけです。これは由来はともかくとしてキメラ自体は他のケースでたくさんできています。Article Extended Data Figure 7-6で、264個のキメラ胚に対して64個体のキメラを得ています。24%の達成率です。FACS選別ですり抜けた細胞の量を全体の1%とすると酸浴して残るのもそのままの含有率でとみなせる。20個づつ入れるとして5280個の細胞の中の1%というのは52個です。これが均等にばらまかれてすべてキメラになったと仮定するとほぼそういう結果になりますね。ESでも半分くらいしかできないと仮定しても含有率を2%と条件を少し変えるだけで可能になりますね。

[FACS7]
①この2Nキメラとされているゲル2写真は偽物である
②本物であるが白血球を除去し忘れている
③本物であるが、FACSで選別しきれなかったT細胞以外の脾臓構成細胞のSTAP由来キメラである

こういう理解で、この3つを検討すればよろしいですか? 以上です。
  1. 2019/06/09(日) 09:12:05|
  2. 学さんブログ検討記録
  3. | コメント:0

学さんブログでの検討記録36

一言居士さん、コメント消しませんでしたか?
探しても無いのですが・・・。
2019/6/5(水) 午後 10:10
返信する

[何でございましょうか1]
>>学さん
>一言居士さん、コメント消しませんでしたか?探しても無いのですが・・・。

私は今ジムさんのところに原稿送っていますので、ここには書き込んでいませんよ。過去の投稿コメントはあなたしか消せないと思いますが、どういう意味なのかよく分かりません。ただ単にお呼びになったということなんですかね。

[何でございましょうか2]
今の私の理解はD2を跨ぐ切り取りがあり得るのかということと、やっと相同染色体の両方で別々のDJリコンビネーションが起きるのかなと気づいたところで、その確認までは行ってませんが、吉村氏の説明と自分の理解が一応一致したばかりです。以下ですね。
>>
①GLの1バンド(両方ともGL)
②GLの1バンド(片方がGLで、他方は検出不能)
③組み換えの1バンド(片方が組み換え、他方が検出不能)
④GLと組み換えの2バンド(片方がGLで、他方が組み換え)
⑤組み換えだけの2バンド(両方が同じ組み換えはあり得ないので別の組み換え)
⑥検出無し(両方が検出不能)

[何でございましょうか3]
私にとってはntES仮説の否定に結末するかもしれない大事なところなのでゆっくに確認しています。今問題になっている2-gの2レーンのLimphocyteと3レーンのTcell STAP #1の酷似はあなたと同様の解釈をしていましたが、そもそもGLラインとリアレンジメント領域が近くてゲル1,2とは違う実験ですね。ただし、マテメソに(Dβ2: 5′-GCACCTGTGGGGAAGAAACT-3′ and Jβ2.6: 5′-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3′)で挟んだとあるのでプライマーは同じだと思っています。特許図はいよいよ別の実験でプライマーも同じかどうかわかりませんね。
今、Limphocyteと3レーンのTcell STAP #1の酷似は一つの試料を3等分して一つはPCR、二つは酸浴させて、#1と#2になったと考えるのはおかしいと気付いているところです。

[何でございましょうか4]
先に#2ですが、これは酸浴させて後に①②③④⑤のどれもOct4-GFPを発現しなかったということですね。ここには丹羽さんのGFPの漏れ出し現象や、GFP蛋白のみの残存(マクロファージの体内)もしくは最悪だと目視で蛍光している細胞だけ選択すると自家蛍光も混在し得ると思いますが、基本FACS( fluorescence-activated cell sorting=flow cytometers)選別ですから自家蛍光は無いと思いますね。あのねさんがGFP選別だとおっしゃってるが、私はそれだけでなく分子レヴェルでも光学選別できると聞きかじっているので、蛋白質の選別もできると思ってましたけどね。CD45+で選別するのはそれですよね。だからあるとしたら前者二つですね。
#1の場合は、GLに並んでいた細胞がOct4-GFPもしくはOct4蛋白選別で外れたと考えればいいとみていたわけです。

[何でございましょうか5]
でも根本に戻って、最初にひとつの試料を3等分した時の、三分の一の試料である2-gの2レーンのLimphocyteの中はほぼ7つのバンドが出ているわけです。元の試料の中には別々の再構成を起こしている無数の細胞が存在していて、小保方さんのDβ2:とJβ2.6で挟んだ部位のみに再構成を起こしている断片が4から8個あったということです。そして残りの三分の二を二等分したものにもそれぞれ、別々の再構成を起こしている無数の細胞が存在しているが、2-gの2レーンのLimphocyteの中で捕まった7バンドにでた再構成細胞と同じものは存在していませんから、Tcell STAP #1に同じレーンは出ませんね。そもそも小保方さんのプライマーで挟んだ狭い領域で存在し得る再構成の組み合わせは15通りとGLの再構成無しの断片を入れて16通りですが、最初に2-gの2レーンのLimphocyteの中で7つのバンドで捕まえたものは別の三分の二の中にはあり得ません。

[何でございましょうか6]
すると、これは同じものを3等分したのではないということになる。しかも別の実験だとしても、そもそも何兆という種類の再構成のあるTCR再構成で同じものは一つもありませんから、この実験の写真を撮ったのは誰かということが大問題になるわけです。私はど素人なんで考え落ちが無いかどうか慎重に確認しながら考えているんです。先生と違って、私には搦め手からの証拠もあるのでここだけの話しで、すべてを簡単にぺしゃんこにしてしまうことはできないんです。事件に関するいわば土器の破片はほぼすべて噛み合ってるんです。私にとっては今ここだけ噛み合わないという大問題が起きているんです。ここを嚙合わせると他の噛み合いに影響してきます。全体の修正も必要になってくるんです、慎重足らざるを得ないんです。以上です。

[どうしてでしょうか?1]
先生、[何でございましょうか1]と[何でございましょうか6]がアップされていませんが? そのために、1から始まり、以上で終わる形にしております。以上です。2019/6/6 10:29



  1. 2019/06/06(木) 09:02:02|
  2. 学さんブログ検討記録
  3. | コメント:0

学さんブログでの検討記録35

[内緒モード1]
>>学さん
>T細胞並みのTCRが出た特許図20があることが大事なのです。そこだけの理解でも、十分、次の考察に進めると思いますけど。

このコメントはアップしないでください。ご自分が特許図の実験結果から演繹論証した命題にお気づきでないんですか? そんな筈はないと思いますけど。(T細胞並みのTCRが出た)ことがまず第一に重要なのではありませんよね。あなたが実証実験結果から演繹論証したのは(T細胞由来キメラが作られていて、太田受精卵ESも、学生のGOF由来ntESも、「僕のマウス」ESもここでは使われていない。それらのESはいずれも血液ですらない細胞由来だ。T細胞由来キメラは若山さんが作った。)という命題ですね。桂報告書の結論は否定されている。論文通りのキメラであったかどうかはまた別問題ですね。

[内緒モード2]
我々は搦め手側からすでにしたらば考察で桂報告書の結論否定の間接証明は終えてるんです。でも、これほど直接的な証明は気づいていなかった。これはあなたが気づいたんだ。そして気づいた結果、仮にあなたの論文通りのキメラがあるという仮説が僕の仮説によって否定されたとすると、そのとき若山さんはどうなるのだろうと思わず逡巡したから、内緒モードなどとおっしゃり始めたんじゃないのですか。僕がなぜしたらば書き込みを便所の落書きだとこだわってるのかの真の理由に気づかれましたか。馬鹿なマスゴミは今度は若山さんを殺してしまうでしょう。

[内緒モード3]
僕のブログはここです。*ttps://kyobera.blog.fc2.com/
引っ越し作業中ですからカテゴリの連絡掲示板以外には書き込まないでください。無論他の人には他言無用です。ここを知っているのはジムさんと僕の友人一人だけですが普段は彼らはここを見ていません。あなたの指定HNは"清少納言"です。僕があなたに返事するときのHNは"小野小町"です。ここを公開するときにはやり取りは消します。以上です。



彼女からの応答はなく以後も私のコメントをアップしないまま私の質問や意見に関して一方的に語り続けているのでコメント投稿をやめている。
  1. 2019/06/03(月) 19:35:29|
  2. 学さんブログ検討記録
  3. | コメント:0

学さんブログでの検討記録34

[学さんへの質問1]
>>学さん
UP有難うございます。Lさんが答えてくれるか否かは彼の意志ですから先生は関与なさらない方がよいのではないですか。
胸腺から脾臓に入る過程でT細胞の受容体変化がどういう時系列で起きるのかは私は知りません。ただ、Extended Data Figure 2-eに小保方さんが示しているリコンビネーションの概念図があって、これはご教授いただいているVDJ再編成後の長さですね。これがGLの長さでしょ。二つのプライマーもマテメソに示されています。続いて相同染色体の片方にα鎖のVJ再編が起きる。二つのプライマーもマテメソに示されています。原則として対立アレルのGLは必ず残りますね。

[学さんへの質問2]
この件に関して吉村氏は以下のように説明しています。
>>
ともさんの疑問についてですが、VDJ組み換えではDJが先行して起こりますので両方の染色体でDJ組み換えが起きます。
次にVDの組み換えが起きますが、対立遺伝子排除の機構は主にこの時期に働きます。つまりまずD1J1, D1J2, D2J2の組み換えのいずれか、あるいはD1J1とD2J2の両方の組み換えが両アレルで先に起こって、それからどちらかのアレルのVがDJとくっつく。ここで機能的なTCRβができればもう片方のVD組み替えは起こりません。これが対立遺伝子排除といわれる現象です。もし機能的なTCRβが出来なかった場合はもう片方の染色体でVDの組み換えが起きます。

[学さんへの質問3]
ここまでの理解だと(GL0本)のケースは原理的にありませんね。でも、現にPCR結果に実例が2つもあり、原理的にもあると吉村さんがおっしゃっているわけですから私の理解が間違ってるのは明確ではないですか。これが重要でなくてなんでしょう。教えていただきたいんですけどね。以上です。



[プライマーの選択間違い?1]
>>学さん
>D2J2のプライマーで検出される部分は、TCR遺伝子DNAの一部です。ここを理解できれば、全貌が見えます。

ということはGLの検出に使われている(Dβ2: 5′-GCACCTGTGGGGAAGAAACT-3′ and Jβ2.6: 5′-TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT-3′)がそもそもの実験目的にあってないということではありませんか。そんなことあからさまに言ってる専門家今までいませんでしたよね。笹井さんはこれでいいとしたんでしょ。遠慮があるのですかね。

[プライマーの選択間違い?2]
この理解だとPCRの原理から考えてD2J2自体がリコンビネーションで切り取られて存在してないということになりますね。90%は切り取られていると。どうして今までそれを問題にしなかったんですか。

[プライマーの選択間違い?3]
忘れないでいただきたいが、この細胞はESだと言われてましたよね。ES細胞はリコンビネーションなんて起こしませんね。以上です。


[γδTCRだってあるよ?1]
吉村さんは一個の細胞で0本とおっしゃった。そのときに0本はあるという原理はわかりました。90%という場合は複数個入っているケースて゛、現実のキメラ実験のケースですね。すべての尾部体細胞が1個のT細胞ドナーでできていた時の話と違う。でも吉村さんはわざと話を混同させていますね。
>>
胚盤胞に入れられる細胞はせいぜい20個でそのうちマウス組織になるのは数個なので、

ESの場合は全部ですよね。STAPの場合はどうして数個と決めつけているのでしょうかね。無論私の説の場合はゼロですけどもね。キメラは出来てない。

[γδTCRだってあるよ?2]
特許図は受精卵ESではないですね。この場合はGLのみに現れる。キメラ尾部の場合はGLのないのはαβTCR型でないT細胞、もしくはD2J2の切り取られたαβTCR型のT 細胞なんですね(こんなことがあり得るのか否かはまだお返事を頂いていませんが)。
でもラダーは1本と言わず別にありますから、血液が入ったか、数十個のドナー細胞が尾部に入ったということになるが、後者は胚様の分化順序からして考えにくいですね。だから血液でいいんじゃないですか。
私の仮説では小保方細胞核使用ntESキメラに血液が入ったという実験結果という解釈になる。
学先生ご説のようにこれは受精卵ESでは絶対にない実験試料ですね。

[γδTCRだってあるよ?3]
西川さんは何を教えたのでしょうかね。或いは笹井さんはこのことに気づかなかったのか。また吉村さんはES細胞ではあり得ないとどうしていわないのでしょうかね。以上です。


> 一言居士さん

>D2J2自体がりコンビネーションで切り取られて存在してないということになりますね。

D2J2遺伝子を選ばなかったT細胞があります。各D、Jの遺伝子の中からD2J2領域が選ばれたT細胞で、D2J2プライマーが有効です。

全貌を理解したいなら、ここでのコメント合戦で理解するのは難しいです。図を見ながら周辺の勉強をしてください。吉村氏の説明を何度も読んでください。

こうした交錯した議論は、ため息グループが喜びますからこれ以上は止めましょう。
2019/6/2(日) 午前 9:52
返信する

[これ以上1]
>>学さん
>こうした交錯した議論は、ため息グループが喜びますからこれ以上は止めましょう。

どうでもいいことをおっしゃる。
γδTCR型のT細胞の存在があるから、吉村さんの説明のケースでGLの0本があり得るんですね。そう説明されたらわかりますよ。それとαβTCR型のT 細胞であった場合、GLは対立アレル側の分が必ず出ますね。それからD2J2部分が切り取られて無くなるようなαβTCR型のリコンビネーションはないということでいいですね。1個のT細胞がキメラになった場合、吉村氏の言うように、
①γδTCR型のT細胞ではB鎖ができないからGLラインは出ない。
②αβTCR型のT 細胞ではリコンビネーションが起きていない細胞ではGLだけが1本出る。
③αβTCR型のT 細胞でリコンビネーションが起きている場合はGLと再構成された長さのPCR産物の1本で計2本出る。
ということでいいですね。

[これ以上2]
やっと次に進めます。
今、特許図に絞っていますが、このキメラ尾部細胞は受精卵ES細胞でもなく、リンパ球を使ってないntESによる捏造キメラでもない。
ここはあなたの証明でしたね。異論はありませんよね。そして、吉村氏とLさんはそのことに気づいていないのですね。

[これ以上3]
この後でやっと本物だったか、ntESであったかの話に入れますね。でも以上確認いただきたい。以上です。

  1. 2019/06/02(日) 10:41:27|
  2. 学さんブログ検討記録
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